Как регулировать степень освещенности препарата
Как настроить микроскоп: инструкция по эксплуатации
Микроскоп, работающий в светлом поле – один из самых распространенных в учебной работе типов микроскопов. Свет от источника под предметным столиком освещает поле зрения и дает разрешение деталей размером 0,2–2,1 мкм. Большее окулярное увеличение обеспечивает большую разрешающую способность. Светлое поле – самый распространенный метод исследований в учебных и детских моделях микроскопов. В этой статье мы кратко опишем общую работу с микроскопом – инструкцию по эксплуатации большинства детских моделей.
Сложность настройки: средняя.
Требуются: микроскоп с возможностью работы в светлом поле и регулируемой подсветкой, готовый микропрепарат.
Детский микроскоп: как пользоваться
Общие инструкции:
Детский микроскоп: как пользоваться фокусировкой и исследовать препараты:
Работа с подсветкой:
Если вы приобрели детский микроскоп, полная инструкция должна быть в комплекте. В этой статье приведены лишь краткие советы.
4glaza.ru
Апрель 2020
Статья обновлена в апреле 2021 года.
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Настройка освещения по Келлеру. Видеоурок
Современные лабораторные микроскопы профессионального уровня предусматривают специальную методику настройки освещения по Кёллеру. Впервые подобный принцип освещения был предложен в 1893г. немецким профессором Августом Кёллером, сотрудником компании Carl Zeiss, и с тех пор широко применяется в области традиционной микроскопии. Техника настройки освещения по Кёллеру позволяет добиться наилучшего разрешения и контраста для визуальных наблюдений, и особенно важна для микрофотографии. Естественно, настройка освещения по Кёллеру используется в биологических микроскопах при наблюдениях в светлом поле, при этом играя более критически важную роль при проведении исследований специальными методами, например, фазово-контрастной микроскопии.
Важно помнить, что настройка освещения по Кёллеру должна производиться для каждого объектива отдельно. Кроме того, не меньшую роль играют и толщина используемого предметного стекла, и непосредственно сам образец. Так, в случае если лаборатория работает исключительно со стандартизированными стеклами одной толщины и одним типом образцов, проводя исследования, например, именно со 100х объективом (например, лаборатория, занимающаяся гистологическими исследованиями), то в таком случае будет вполне достаточно единожды выполнить настройку. В противном же случае, Вам придется выполнять рутинную процедуру настройки освещения снова и снова.
Итак, вывод 1. Настройка освещения по Кёллеру осуществляется, исходя из трех факторов:
*Заметка 1. Обратим внимание, что правильная настройка освещения по Кёллеру играет более критическую роль при наблюдениях с объективами сухого типа, чем с масляными объективами.
К сожалению, не все современные лабораторные микроскопы имеют возможность настройки освещения по Кёллеру. Поэтому при выборе профессионально микроскопа следует обращать внимание на наличие:
Как же собственно выполнить настройку освещения по Кёллеру?
Пошаговая инструкция настройки освещения по Келлеру
Шаг 1. Устанавливаем микроскоп на рабочий стол и подключаем его к сети. Включаем источник освещения.
Шаг 2. В препаратодержателе координатного столика микроскопа фиксируем предметное стекло с образцом, окрашенным должным образом. Убедимся, что предметное стекло расположено ровно, без перекосов слегка придавив его по обеим сторонам.
*Заметка 2. Не следует прикладывать слишком много усилий при нажатии на предметное стекло, чтобы не повредить механизм перемещения столика вверх/вниз.
Шаг 3. Необходимо полностью открыть полевую диафрагму линзы коллектора и апертурную диафрагму конденсора ирисового типа вращением соответствующих регулировочных колец или рычагов.
Шаг 4. Конденсор микроскопа следует аккуратно поднять вверх до упора, используя соответствующий регулировочный механизм (ручка либо рычаг), как правило, расположенные слева под предметным столиком.
*Заметка 3. Обратите внимание, что конденсор не должен упираться в предметное стекло, так как может попросту сместить его из препаратодержателя. Как правило, производители оптических приборов предусматривают ограничитель поднятия конденсора максимально вверх, так что заводская настройка и не позволит линзе конденсора соприкоснуться с предметным стеклом. В то же время, случается, что линза конденсора случайно вывинчена и упирается в предметное стекло, в таком случае необходимо аккуратно закрутить линзу обратно.
*Заметка 4. Большинство микроскопов оснащено конденсорами единой конструкции, однако встречаются и модели с конденсорами с откидной фронтальной линзой (например, микроскопы Konus Biorex-3, Konus Infinity-3, Ulab XY-B2T и др.) либо же дополнительной нижней линзой (например, микроскоп Bresser Science TRM-301), вводящимися или выводящимися из хода лучей соответствующим образом. Установленная наверх откидная фронтальная линза уменьшает фокусное расстояние конденсора, в то время как дополнительная нижняя линза, наоборот, увеличивает его фокусное расстояние, что, в свою очередь, естественно, влияет на размер изображения апертурной диафрагмы в плоскости препарата. В таких случаях, выполняя процедуру настройки освещение по Кёллеру для объективов малых увеличений, следует откинуть верхнюю откидную линзу коллектора, либо же ввести нижнюю дополнительную линзу.
Шаг 5. Выбираем объектив, для которого будет проводиться настройка освещения по Кёллеру. Обратим внимание, что, как правило, объективы малых увеличений 4х и 10х в лабораториях используются не для непосредственного проведения исследования, а лишь для поиска препарата и центрирования его в поле зрения. Таким образом, наблюдения обычно проводятся, постепенно переходя от объективов с малыми увеличениями к объективам с большей кратностью. Наиболее часто первым объективом для настройки освещения по Кёллеру принято выбирать 10х объектив.
Шаг 6. Наблюдая в окуляры микроскопа регулируем кольцо реостата источника освещения для достижения наиболее комфортной для глаз интенсивности освещения препарата так, чтобы освещение и не слепило, но и картинка не была темной.
Шаг 7. Используем ручки грубой и точной фокусировки для настройки максимально возможной резкости изображения препарата.
Шаг 8. Полностью закрываем полевую диафрагму линзы коллектора вращением соответствующего регулировочного кольца. При этом необходимо убедиться, что в окуляры будет видно изображение полевой диафрагмы или ее часть.
Шаг 9. С помощью механизма юстировки конденсора по высоте опускаем его вниз до тех пор, пока не увидим резкое изображение полевой диафрагмы, т.е. четко очерченные контуры многоугольника.
Шаг 10. В результате выполнения предыдущего шага мы можем обнаружить, что наш многоугольник находится вовсе не в центре поля зрения микроскопа, что говорит о необходимости центрирования конденсора с помощью двух юстировочных винтов, расположенных в оправе-держателе конденсора. Таким образом, необходимо добиться расположения полевой диафрагмы по центру как можно более точно.
*Заметка 5. Выполняя центрирование конденсора, будьте осторожны и не сместите его положение, установленное по высоте.
Шаг 11. Успешно завершив центрирование конденсора, следует аккуратно приоткрыть полевую диафрагму так, чтобы края многоугольника почти выходили за границу поля зрения.
*Заметка 6. При необходимости следует немного подкорректировать центровку конденсора.
Убедившись в должной центровке конденсора, раскройте полевую диафрагму ровно на столько, чтобы освещалось все видимое поле зрения, но не более. Полностью раскрывать полевую диафрагму не следует, так как это может привести к ухудшению качества изображения, в частности к снижению контрастности из-за чрезмерной засветки.
Шаг 12. Последним пунктом настройки является регулировка апертурной диафрагмы конденсора. Считается, что для достижения наилучшего контраста без потери разрешения и деталей изображения апертурная диафрагма должна быть открыта на ≈65-80% от числовой апертуры объектива. Часто для такой настройки из окулярного тубуса микроскопа вынимают окуляр и, наблюдая на расстоянии 10-20см, регулируют диаметр апертурной диафрагмы так, чтобы осветить около ≈65-80% диаметра зрачка.
*Заметка 7. Описанный выше метод регулировки диаметра апертурной диафрагмы может показаться не очень удобным. По этой причине многие современные микроскопы оснащены специальной шкалой на конденсоре, позволяющей максимально комфортно и оперативно выполнять настройку. Нанесенная градуировка на конденсоре может быть выполнена в двух вариациях:
*Заметка 8. При микрофотографии часто оказывается полезным использование светофильтров. Снижение напряжения и, как следствие, яркости изображения может привести к преобладанию в спектре теплых тонов из-за увеличения красной и уменьшения синей составляющих. Во избежание подобного явления для снижения интенсивности света рекомендуется использование нейтральных серых светофильтров, устанавливающихся перед конденсором. Кроме того, при исследовании образцов, для которых не очень важен цвет (например, хромосом), может оказаться полезным синий светофильтр, характеризующийся более короткой длиной волны и высокой разрешающей способностью. Таким образом, синий светофильтр повышает разрешающую способность микроскопа и улучшает качество картинки.
*Заметка 9. Выполнять процедуру настройки освещения по Кёллеру следует исключительно при визуальном наблюдении в окуляры, так как цифровые камеры для микроскопов характеризуются существенно более узким полем зрения, то наблюдая изображение на экране ПК, настройка освещение по Кёллеру будет менее точной и эффективной. Поэтому при занятии микрофотографией процедура настройки должна быть выполнена все равно при визуальном наблюдении.
Преимущества настройки освещения по Кёллеру
Что же собственно дает такая «утомительная» рутинная процедура, как настройка освещения по Кёллеру? Не вдаваясь в подробности и дебри науки, стоит сказать, что достоинствами осветительной системы по принципу Кёллера являются равномерное освещение объекта, возможность регулировки освещенности (числовой апертуры конденсора) и освещаемого поля объекта, а также обеспечение телецентрического хода лучей. Регулировка полевой диафрагмы влияет на величину освещаемого поля зрения, а регулировка апертурной диафрагмы – на яркость, контрастность изображения и разрешающую способность микроскопа.
Таким образом, на сегодняшний день принцип освещения по Кёллеру является наиболее распространенной системой освещения в профессиональных лабораторных микроскопах, наиболее рациональным, сбалансированным и оптимальным методом освещения препарата.
Правила работы с микроскопом и его настройка
Если вы желаете приступить к изучению микромира, вам следует изучить правила работы с микроскопом. Независимо от того, какой инструмент у вас будет, общие принципы обращения с ним выглядят примерно одинаково. Конечно, при работе с разными видами техники (биологическим, стереоскопическим и, наконец, цифровым микроскопом) есть ряд отличий и нюансов, но в целом алгоритм действий при настройках и работе не сильно меняется.
Как настроить микроскоп?
У инструментов, которые не относятся к простым «детским игрушкам», окуляры и объективы устроены так, что в них имеется по две линзы и более. Такая оптическая конструкция позволяет избежать искажений и даёт чёткую картинку. Её можно регулировать с помощью разных элементов микроскопа. Научиться этому вы сможете, воспользовавшись простым алгоритмом действий. Рассмотрим его подробнее на примере работы с простым биологическим микроскопом:
Теперь смотрите одним глазом в окуляр и вращайте винт грубого наведения к себе. Таким образом объектив поднимется до того уровня, который позволит вам хорошо рассмотреть препарат.
При работе с любым микроскопом соблюдайте важную меру предосторожности. Никогда не смотрите в окуляр, одновременно опуская объектив. Опускать его всегда нужно, следя за процессом сбоку, чтобы покровное стекло и линза всегда находились на безопасном расстоянии друг от друга.
Если вы хотите больше увеличить изучаемый объект, выберите один из его участков и поместите его в центре поля зрения микроскопа. Смените окуляр на увеличение до 40, поставив револьвер в рабочее положение. Хорошего изображения вы добьётесь, вращая микрометренный винт так, чтобы его точка всё время находилась между двумя рисками, не выходя за их пределы.
Как работать со стереомикроскопом?
В отличие от «классического» биологического микроскопа стереомикроскоп оснащён двумя окулярами, а диапазон увеличения у него не такой большой. Он может колебаться от 10 до 100 крат, хотя есть более «продвинутые» модели, увеличивающие объект и в 200 крат.
При работе со стереомикроскопом вам не потребуется постоянно прищуривать один глаз, потому что инструмент оснащён двумя окулярами. При этом, изображение вы сможете увидеть под разными углами и в «режиме» трёхмерного пространства. В качестве освещения используйте подсветку сверху. Подавляющее большинство стереомикроскопов оснащены именно ею, однако есть модели, оборудованные несколькими видами подсветки (нижней и даже боковой).
Скорее всего, вам достанется стереомикроскоп, у которого есть поворотная револьверная головка. С её помощью вы сможете устанавливать увеличение на выбор (одно из двух). Есть инструменты, имеющие фиксированное увеличение.
Стереомикроскопы лучше использовать для того, чтобы изучать непрозрачные объекты (минералы, металлические и деревянные изделия, крупные насекомые и многое другое). Также они могут использоваться с целью ремонта электронных плат или часовых механизмов.
Так ли сложен цифровой микроскоп?
Как пользоваться микроскопом, если речь идёт о цифровом инструменте? Главная задача цифрового микроскопа — преобразовывать визуальную информацию в цифровую и выводить оцифрованное изображение на экран компьютера. Это значительно облегчает процесс наблюдений, особенно если в них принимают участие несколько человек.
Прежде всего, вам понадобится установить на компьютер соответствующее программное обеспечение. Установить его просто: нужно вставить диск в дисковод и следовать командам, которые появляются на экране. По окончании всех операций на рабочем столе вашего ПК появится новый ярлычок.
После установки ПО необходимо:
Перед установкой программного обеспечения нужно узнать, совместимо ли оно с той операционной системой, которая установлена на вашем компьютере. Если с совместимостью всё в порядке, с установкой и настройками проблем возникнуть не должно.
Независимо то того, с каким микроскопом вы будете работать, помните о том, что одним из главных критериев успешных наблюдений является хорошая оптика. Также и качество управляющих элементов является не менее важным. Именно поэтому к выбору следует подходить объективно, чтобы в будущем совершать для себя интересные и познавательные открытия.
Как регулировать степень освещенности препарата
Различают простые и сложные световые микроскопы. Оптика простых микроскопов представлена одной линзой с большим увеличением. В сложных микроскопах оптическая система состоит из объектива для получения увеличенного изображения объекта и окуляра для дальнейшего увеличения полученного изображения и его рассматривания.
Современные световые микроскопы, позволяющие не только увидеть микроорганизмы, но и изучить их структуру, это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.
В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части относится штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания и трансформатором. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса.
Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра и дающий возможность наблюдения двумя глазами) тубусы. Кроме того, тубус микроскоп может быть прямой вертикальный (в основном для фотографирования) и наклонный.
Основную роль в получении четкого изображения играет объектив. Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
На рис. 2 показана схема хода лучей в микроскопе.
Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40×) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100×).
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40×). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя. Он состоит из нескольких линз, превращающих параллельные лучи от осветителя в сходящиеся. Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значение для правильного освещения препарата. Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, накал которой можно регулировать, коллекторной линзы и полевой диафрагмы (от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате). Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала. Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения.
Настройка освещения и фокусировка микроскопа. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Кёлеру, который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3) помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
Внимание! Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора.
7) открывают апертурную диафрагму конденсора, прикрывают полевую диафрагму осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10×), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата;
9) слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1 /3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;
11) при смене объектива необходимо проверить настройку света.
Внимание! После окончания настройки света по Кёлеру ни в коем случае нельзя изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диафрагмы.
Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.
Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10×) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе.
При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой (беличьей) кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя.
По окончании работы на микроскопе необходимо прежде всего тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.
Фазово-контрастная микроскопия
Световые волны характеризуются длиной волны, амплитудой и фазой. Глаз человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность, яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.
При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды (уменьшение яркости света) и избирательное поглощение света определенной длины волны (изменение цвета).
При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз изменений заметить не может и эти объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.
Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом биологическом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов со специальными фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа.
Настройка фазового контраста в основном заключается в следующем:
1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;
2) устанавливают объектив малого увеличения и отверстие в диске конденсора без кольцевой диафрагмы (обозначенное цифрой «0»);
3) настраивают свет по Кёлеру;
4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;
6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Наша промышленность выпускает устройство КФ-4 для позитивного фазового контраста.
Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнопольную микроскопию.
Темнопольная микроскопия
Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Существует несколько типов таких конденсоров, различающихся по устройству.
Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света.
Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой.
При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.
Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, поэтому следует применять более мощные осветители и максимальный накал лампы.
Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:
После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия
Цвет люминесценции обычно смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается невидимым ультрафиолетовым излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.
Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим:
1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных люминесцентных осветителях, которые устанавливают на обычный микроскоп, применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ).
2. Наличие системы светофильтров: а) возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;
б) теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию кроме того выполняет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная дистиллированной водой. Эта кювета установлена непосредственно после коллектора.
При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое внимание на то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы вода была абсолютно чистой и прозрачной, поскольку при длительной работе микроскопа в воде могут размножаться микроорганизмы и она мутнеет;
в) «запирающие» светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.
В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который используется во всех отечественных люминесцентных микроскопах. Этот способ заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив и представляющая собой полупрозрачное зеркало, которое избирательно отражает и направляет в объектив только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию, а пропускает в окуляр только свет люминесценции.
Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква «Л». При работе с объективами масляной иммерсии при люминесцентной микроскопии пользуются специальным нелюминесцирующим иммерсионным маслом.
Правила настройки люминесцентного микроскопа подробно изложены в инструкции к микроскопу.
На рис. 3 показан люминесцентный микроскоп «Люмам», выпускаемый Ленинградским оптико-механическим объединением (ЛОМО).
Рис. 3. Микроскоп люминесцентный исследовательский серии ‘Люмам ИЗ’
Для изучения микроорганизмов в люминесцентном микроскопе их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что применяются в очень малых концентрациях (До нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не только фиксированные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также используется для регистрации результатов реакции иммунофлюоресценции (РИФ) (см. главу 12).
Электронная микроскопия
Различные способы световой микроскопии позволяют изучать сравнительно крупные микроорганизмы (бактерии, простейшие), но не дают возможности наблюдать объекты, величина которых меньше чем 0,2 мкм, так как разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны видимого света. Поэтому в световом микроскопе не может быть изучено строение вирусов.
Принципиально новые возможности для изучения тонкого строения бактерий и вирусов появились после изобретения электронного микроскопа.
В электронном микроскопе вместо световых волн для построения изображения используют поток электронов в глубоком вакууме.
В качестве «линз», фокусирующих электроны, служит электромагнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся также в глубоком вакууме, поэтому подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается. В связи с этим в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, что значительно меньше толщины вирусных частиц. Разрешающая способность современных электронных микроскопов равна 0,15 нм, что позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз.
Электронный микроскоп по своим размерам и сложности устройства очень отличается от светового. Колонна микроскопа, в которой находится объект и разгоняются электроны, превышает рост человека, а для размещения микроскопа нужна отдельная комната.
Контрольные вопросы
1. Из каких основных частей состоит микроскоп?
2. Как правильно настроить свет в микроскопе?
3. В чем принцип фазово-контрастной микроскопии?
4. На чем основана темнопольная микроскопия и когда ее используют?
5. На чем основана люминесцентная микроскопия?
6. Что такое электронный микроскоп и какова его разрешающая способность (увеличение)?